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用生化培養(yǎng)箱做免疫熒光實(shí)驗(yàn)

更新時(shí)間:2024-03-19  |  點(diǎn)擊率:627

生化培養(yǎng)箱做免疫熒光實(shí)驗(yàn)的流程如下:

1、細(xì)胞準(zhǔn)備

(1)取出生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,棄培養(yǎng)基,消化重懸細(xì)胞。
(2)將24孔圓形爬片放入24孔板的孔中。
(3)根據(jù)細(xì)胞生長特性取適量細(xì)胞于已鋪爬片的24孔板中,放入37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2、固定
(1)取出細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗細(xì)胞3次。
(2)每孔加入1mL的4%多聚甲醛,室溫固定10-20min,棄去多聚甲醛;
(3)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞,重復(fù)兩次。
3、通透
(1)每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ,室溫10min,棄去Triton-X100。
(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞,5min,棄PBS。重復(fù)兩次。
4、封閉
每孔中加入1mL的3%BSA封閉液,室溫封閉1h。棄封閉液。
5、一抗結(jié)合
(1)向爬片上滴加稀釋好的一抗,用錫箔紙包住24孔板外面,輕柔的將24 孔板放置于4℃生化培養(yǎng)箱中,過夜孵育。
(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞,5min,棄PBS。重復(fù)五次。
6、二抗結(jié)合
(1)加封閉液稀釋的二抗室溫避光孵育1h。
(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞,5min,棄PBS。重復(fù)五次。
7、DAPI染色
(1)按照1:4000比例用1×PBS稀釋DAPI工作液(參照廠家說明書),并向每個(gè)孔中加入1mL的DAPI工作液,避光靜置染色10min。
(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞,5min,棄PBS。重復(fù)三次。
8、封片及檢測
(1)將爬片小心取出,用吸水紙吸干多余液體,加5μl的抗熒光淬滅劑到載玻片上。
(2)將爬片倒置載玻片上,周圍涂指甲油固定。

(3)4℃生化培養(yǎng)箱暫存或直接激光共聚焦顯微鏡拍攝。

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